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本试剂盒适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA，既可用于小量样品(50～100mg组织、5×10⁶细胞)，也可用于大量样品(>1g组织、>10⁷细胞)，提取的总RNA质量高，可用于Northern Blot、Dot Blot、polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。

• 液氮、研钵或匀浆器、低温高速离心机、低温冰箱
  
• 经RNase free处理的移液器吸头、EP管等耗材
  
• 无菌PBS缓冲液

• 样品保存：加入RNA提取液混匀后样品可在-70℃放置1月；RNA样品可以在70%酒精中-70℃保存2～4周；如果需要长期保存，应置于超低温冰箱中保存。
  
• RNA提取液和RNA分离液含有腐蚀性物质，污染皮肤或眼睛后，立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。

• 实验准备：RNA分离液室温放置15min确保两相分开，无菌PBS缓冲液、RNA提取液和RNA沉淀液冰上预冷。
  
• 样品准备
  
  • 贴壁细胞：
    ①直接裂解：直接在培养瓶/皿中加入RNA提取液裂解细胞，每10cm2面积加1mL，用移液器吹打混匀。
    ②胰蛋白酶消化：用无菌PBS洗涤细胞后，加入含有0.05～0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁后，加入含有血清的培养基终止反应，将细胞溶液转移至无RNase的离心管中，以下参考悬浮细胞相关操作步骤。
    
  • 悬浮细胞：收集(1~5)×10⁶～10⁷动物、植物和酵母细胞或107细菌细胞加至1.5mL离心管，5000～6000g离心5min，用无菌PBS重悬细胞沉淀，再次5000～6000g离心5min收集细胞沉淀，去除上清，收集细胞时一定要将溶液去除干净，否则裂解不完全，降低RNA收获率，向沉淀中加入加入0.5mL RNA提取液，充分振荡混匀。
    
  • 组织：取新鲜动物或者植物组织或者-70℃冻存组织，50～100mg组织在液氮中充分研磨或者加入0.5mL RNA提取液研磨或者用匀浆器匀浆处理，样品体积一般不超过提取液体积的10%，研磨要迅速，以1min为佳。
    
  • 血液：取0.5～1mL新鲜或冻存的血液，12000g离心5min，去除血浆，加入0.5mL RNA提取液，充分振荡混匀。
• 核酸分离：将细胞液或匀浆液转移至1.5mL离心管，加入1/10体积的乙酸钠缓冲液，颠倒混匀5～6次，加入等体积RNA分离液，颠倒混匀5～6次后震荡10-20s，冰上放置15min，使核蛋白与核酸完全分离。
  
• 样品分层：12000g 4℃离心10～15min，RNA在上层水相。
  
• 沉淀RNA：吸取上层水相(约0.5mL)转移至新的1.5mL离心管中(不要吸取任何中间层物质，否则会有染色体DNA污染)，加入等体积RNA沉淀液混匀，冰上放置10～15min，12000g 4℃离心10min，离心后管侧或管底形成胶状沉淀，弃上清。
  
• 洗涤RNA：加入1mL RNA洗涤液轻轻洗涤沉淀，冰上放置5～10min，7500g 4℃离心5min，弃上清，室温干燥10～30min，不宜过分干燥，否则RNA难以溶解。
  
• 溶解RNA：加入30～50μL RNase-free ddH2O充分溶解，-70℃长期保存或直接用于后续试验，对于肝、胰腺、肾等组织中RNase含量高的样品沉淀用RNA保存液溶解。

• 测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量，按1OD=40pg RNA计算RNA的产率，OD260/OD 280在1.8～2.0视为抽提RNA纯度较好，浓度在4μg/mL以上的样品适于用分光光度计测定。
  
• 进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定RNA的完整性和污染情况。
  
• 核酸分析仪测定RNA的质量和纯度。